Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) в фармацевтическом анализе.

Введение в состав подвижной фазы 2% метанола позволило сократитьвремя процесса, однако пик НА имел высокую асимметрию и пик Рб накладывался на хвост пика НА. После снижения концентрации метанола до 1% пики Рб и НА не перекрывались, однако асимметрия пика НА увеличилась. С целью ее снижения в подвижную фазу, содержащую 1% метанола, вводили ацетонитрил.В результате была подобрана подвижная фаза - водно-органическая фаза, состоящая из фосфатного буфера рН 7,0, содержащего 1% метанола и 0,5% ацетонитрила, которая обеспечила эффективное разделение всех 5 компонентов (рис. 13). Общее время хроматографированияпри этом составило 35 мин, а времена удерживания компонентов (мин.): у ЯК - 5,3, Пц - 15, ПГ - 19,3, НА - 26, Рб - 31.Количественное определение проведено методом внешнего стандарта с использованием растворов стандартных образцов индивидуальных компонентов.Метрологические характеристики предлагаемой методики количественного определения изучены на модельных смесях и представлены в таблице 3 (среднее значение из 5 повторений).Таблица 3. Метрологические характеристики определения среднего результата компонентов в составе модельных смесей препарата «Аданол» методом ВЭЖХ (р=0,95, n = 5)Компонент fS2SSxt(P,f)x,мг,мг,%ЯК45,952,441,092,786,783,043,0Пц40,9720,9860,4412,782,741,231,8Рб41,3731,1720,5242,783,251,461,9НА40,0430,2070,0922,780,570,261,2ПГ40,01630,1280,0572,780,360,162,1Рис. 13. Хроматограмма в фосфатном буфере с рН 7,0, содержание ацктонитрила – 1%, метанола – 0,5%; НК – никотиновая кислота, ГК – гипоксантинКак следует из таблицы 13, с помощью разработанной методики в препарате "Аданол" можно определять все 5 компонентов с относительной ошибкой не более 3% с доверительной вероятностью 95%.Кроме пиков основных компонентов препарата, на полученной хроматограммеидентифицированы также пики гипоксантина и никотиновой кислоты, присутствующих в исходных субстанциях, а также образующихся в процессе гидролиза Рб и НА соответственно. Таким образом, разработанная методика позволяет качественно и количественно определить эти посторонние примеси в препарате.Теоретическое обоснование механизма разделения в ВЭЖХНаиболее удачными и распространенными объяснениями механизма разделения в ВЭЖХ ОХ являются теория, использующая представления о параметрах растворимости Гильдебранта, и сольвофобная теория Хорвата-Меландера[12]. По теории, основанной на параметрах растворимости Гильдебранта, удерживание определяется молекулярными взаимодействиями разделяемых веществ с подвижной и неподвижной фазой. Зависимость фактора емкости вещества от состава подвижной фазы описывается уравнениемlnk= A2 + B+ C ,где – объемная доля органического компонента (модификатора) в подвижной фазе, А, В и С– константы.Однако поведение соединений сложного строения с несколькими функциональными группами часто не удается описать данной зависимостью. Более адекватно закономерности удерживания сорбатов в ОФ ВЭЖХ описываются сольвофобной теорией. Хорвартом и Миландером впервые было показано, что водные элюенты, не содержащиеорганических растворителей, могли быть использованы для разделения полярных биологических молекул на октадецилсиликагеле. Даже при отсутствии органического компонента в элюенте, взаимодействие между растворенным веществом и привитыми углеводородными радикалами неподвижной фазы, являлось причиной удерживания растворенного вещества. Это позволило сделать вывод о том, что удерживание в обращено-фазовом варианте в основном определяется гидрофобными взаимодействиями.Важнейшую роль в понимании механизма удерживания обращенно-фазовой хроматографии сыграли работы Хорвата и его школы[12, 22-24]. Суть теории Хорвата заключается в принципиальном различии процессов сорбции на полярных поверхностях из относительно неполярных растворителей («нормально-фазовый режим») и сорбции из воды либо сильнополярных растворителей на неполярных поверхностях («обращенно-фазовый режим»). В первом случае, молекулысорбатов и неподвижных фаз образуютассоциаты за счет кулоновских взаимодействий или водородных связей. Во втором случае, причиной ассоциации на поверхности являются сольвофобные взаимодействия в подвижной фазе. Для полярных подвижных фаз характерно сильное кулоновское взаимодействие и образование водородных связей между молекулами растворителей. Для того чтобы поместить в эту среду молекулу сорбата, необходимо образование«полости» между молекулами растворителя.Энергетические затраты на образование такой «полости» лишь частично покрываются за счет взаимодействия полярных групп в молекуле сорбата с полярными молекулами растворителя. В аналогичном положении по отношению к растворителюнаходятся и неполярные молекулы неподвижной фазы. С энергетической точки зрения более выгодно такое положение, когда поверхность раздела между полярной средой (растворителем) и неполярными фрагментами неподвижной фазы и молекул сорбатаминимальна. Уменьшение этой поверхности достигается при сорбции (рис. 14). МолекулыРис. 14. К механизму ОФ хроматографии: а - сорбат в растворе; б - сорбат на поверхности неподвижной фазы.воды и органического растворителя обозначены светлыми и темными кружками соответственно.Процесс сорбции ионогенных веществтакже описывается сольвофобной теорией, однако такие сорбаты существуют в растворе, как в виде нейтральных молекул, так и в виде ионов со своими значениями фактора удерживания. В зависимости от рН среды изменяются соотношение различных форм в растворе и факторы удерживания. Меняя состав ПФ в ОФЖХ, можно изменять и удерживание в широких пределах, используя смеси воды с органическим растворителем – так называемым модификатором. Зависимость фактора удерживания компонента от состава ПФ описывается уравнениемlgk = b +pC ,гдеC – концентрация органического модификатора в ПФ, b и p – константы.При постоянных условиях хроматографирования удерживание различных сорбатов определяется гидрофобностьюсорбатов, дипольныммоментом, объемом их молекул, поляризуемостью, уменьшением площади неполярной поверхности при сорбции.При описании взаимосвязи удерживания и свойств сорбатов наиболее популярны уравнения, связывающие факторы удерживания, измеряемые в хроматографической системе, с коэффициентами распределения (чаще всего в системе октанол–вода). Для соединений близкой структуры наблюдается линейная зависимость между логарифмами коэффициентов распределения ифакторами удерживания:lgk' = a + blgPi ,гдеPi,j- коэффициент распределения между водной и органической фазами.Во многих случаях логарифм фактора удерживания линейно связан с числом повторяющихся структурных фрагментов:lgk' = a + bn .Самым распространенным дескриптором является число атомов углерода. Эти соотношения полезны как при подборе состава подвижной фазы как при разделении, так и для идентификации компонентов смеси[25, 26]. Для решения конкретной задачи состав как ПФ, так и НФ должен быть тщательно подобран с точки зрения как физических, так и химических свойств ее компонентов. Общая схема выбора варианта ВЭЖХ в зависимости от природы разделяемых веществ показана Приложении 5.ЗаключениеВ настоящей работе рассмотрен метод высокоэффективной жидкостной хроматографии и его применение для фармацевтического анализа. Показано, что ВЭЖХ отличается от классического варианта колонками меньшего диаметром, меньшимразмером частиц сорбента, применением давления до 3107 Па для прокачивания элюента через колонку.Рассмотрены основные теоретические положения метода ВЭЖХ, основные особенности каждого из вариантов ее осуществления в зависимости от механизма удерживания разделяемых веществ неподвижной фазой. Описаны основные виды и характеристики хроматограмм; основные виды оборудования. Более подробно рассмотрены типы применяемых детекторов.На основании проведенного в работе анализа имеющихся литературных данных Установлено, что для анализа лекарственных средств применяется в основном обращено-фазовая и ион-парная ВЭЖХ.Рассмотрены современные теоретические обоснования механизмов удерживания веществ. Обосновано,что удерживание в обращено-фазовом варианте в основном определяется гидрофобными взаимодействиями, в то время как ион-парная ВЭЖХприменима для ионогенных веществ. Указаны преимущества ОФ ВЭЖХ по сравнению с другими вариантами.Полученные в работе результаты показывают высокую эффективность использования метода ВЭЖХ при исследованиях ЛС за счет комбинации ограниченного числа сорбентов и неограниченного числа различных по составу подвижных фаз, использования различных видов детектирования,что обеспечивает возможность решения очень большого числа встречающихся на практике задачпо качественному (установление подлинности) и количественному (определение содержания основных компонентов и допустимых примесей) фармацевтическому анализу. СписокиспользованнойлитературыГосударственная фармакопея СССР: 11-е изд. Вып. 2. Статистическая обработка результатов химического эксперимента и биологических испытаний. - М.: Медицина, 1989. - 400 с.Медведев Ю.В., Раменская Г.В. и др.ВЭЖХ и СВЭЖХ как методы для определения лекарственных веществ в крови (обзор) // Химико-фармацевтический журнал. - 2013. - № 4. – С. 45-51.Рейхард Д.В., Барам Г.И. и др. Высокоэффективная жидкостная хроматография в контроле качества лекарственных средств // Мед.вестник. – 2005. - № 2 (20-21). – С. 705-706. – [Электронный ресурс]. – режим доступа: www.medvestnik.ru/library/article/5890.Куркина А.В., Калабухова Е.А. и др. Возможности применения метода ВЭЖХ для стандартизации цветков пижмы обыкновенной // Совр. проблемы науки и обр.: Фарм. науки. – 2013. - № 5. – [Электронный ресурс]. – режим доступа: www.science-education.ru/pdf/2013/5/10031.pdf.Бубунчикова В.Н., Сухомлинов Ю.А. Изучение состава фенольных соединений лапчатки прямостоячей методом ВЭЖХ // Вестник Воронежского гос. ун-та: сер.: Химия. Биология. Фармация. – 2005. - № 2. – 160-161. Гармонов С.Ю., Салахов И.А. и др. Фармацевтический анализ противовоспалительных и анальгезирующих лекарственных средств методом ВЭЖХ // Ученые Т. 152, кн.3. – С. 110-113.Григорьев А.М., Староверов В.М. и др.Новые экспресс-методики определения жирорастворимых витаминов в сиропе «Олиговит» и таблетках «АЛФАВИТ» методом ВЭЖХ // Сорбционные и хроматографические процессы. – 2006. – Т. 6, № 1. – С. 62-69.Евгеньев М.И., Левинсон Ф.С.и др.Влияние кислотности замещенных 5,7-динитробензофуразановых и нитробензодифуразановых производных ароматических аминов на элюирование в ОФ ВЭЖХ // Вестник Казанского технол. ун-та. – 2008. - № 1. – С. 52-56.Евгеньев М.И., Евгеньева И.И. и др.Изучение параметров разделения 5,7-динитробензофуразановых и нитробензофуразановых производных ароматических аминов в ВЭЖХ//Вест.Казан.технол.ун-та. – 2004. - №1. – С.81-88.Писарев В.В., Смирнова Л.Б. и др. Определение азитромицина в плазме крови методом ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием // Клиническая фармокинетика. – 2004. - № 1. – С. 23-26.Фогт В.П., Степанов А.С., Степанова Т.А. Использование методов ВЭТСХ и ВЭЖХ в разработке экстракта противодиабетического // Химия растительного сырья. – 2008. - № 4. – С. 75-78.Буланова Л.В. Хроматография в медицине и биологии: учебное пособие /А.В. Буланова, Ю.Л. Полякова; Федер. агенство по образованию. - 2-е изд. - Самара: Изд-во «Самарский университет», 2006. 116 с.Пунгер В, Григорьева Л. Инструментальный анализ: Учебн.пособие для химико-технологич. спец-тей проф.центров. – Вируамааский колледж Таллиннского технич. ун-та, 2012. – [Электронный ресурс]. – режим доступа: http://itdvnzknu.com.ua/attachments/article/215.pdf.Дубовик Д.Б., Иванов А.В. и др. Влияние сильного электролита в элюенте на удерживание гетерополикислот фосфора и кремния в ион-парной ОФ ВЭЖХ // Вестн. Моск.ун-та: Сер.2: Химия. – 2002. – Т. 43, №5. – С. 300-303.Дутов А., Летунов В. и др. Определение вальпроевой кислоты в биологических жидкостях методом ВЭЖХ с УФ-детекцией и предколоночнойдериватизациейфенацил бромидом // Клинич.фармокин. – 2005. - № 1. – С. 34-37.Мельников И.О., Назимов И.В., Глубоков Ю.М. Анализ низкомолекулярных аминотиолов методами капиллярного электрофореза и ВЭЖХ с флуоресцентной и прямой УФ-детекцией//Совр.наук.технол. – 2005. - №3. – С.40-41.Малинка М.К., Полуэктова М.В., Яшин А.Я. Определение гомоцистеина в плазме методом ВЭЖХ с амперометрическим детектором // Сорбционные и хроматографические процессы. – 2007. – Т. 7, № 1. – С. 60-65.Сапрыкин Л.В. и др.Прямой анализ бетаинов в биологических жидкостях методом ВЭЖХ // Сорбц.ихроматогр.пр-сы. – 2006. – Т. 6, № 1. – С.114-122.Дейнека В.И., Хлебников В.А. и др. Особенности хроматографического поведения берберина в условиях обращено-фазовой ВЭЖХ // Сорбционные и хроматографические процессы. – 2007. – Т. 7, № 2. – С. 228-235.Филимонов В.Н., Сирицо С.И. Параметры гидрофобности для прогнозирования удерживания водорастворимых витаминов неполярным сорбентом в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ // Известия ВУЗов. Сер.: Химия и химическая технология. – 2009. – Т. 52, № 6. – С. 33-35.Рудаков О.Б., Хорохордина Е.А. и др. Определение капсаициноидов и ионола в перцовых пластырях методом микроколоночной ВЭЖХ // Сорбционные и хроматографические процессы. – 2008. – Т. 8, № 2. – С. 339-345.Horvath, Cs., Melander, W., Molnar, J.Solvophobicinteractionsinliquidchromatographywithnonpolarstationaryphases / Cs.Horvath, W.Melander, J. Molnar // J. Chromatogr. - 1976. - V.125. – N 21. – Р. 129-156. Ногvаth, Cs., Melander, W. Liquid chromatography with hydrocarbonaceous bonded phases; theory and practice of reversed–phase chromatography / Cs.Horvath, W.Melander //J.Chromatog.Sci.-1977. - V.15. – N 29. – Р.393-404. Horvath, Cs., Melander, W., Molnar, J. Liquid chromatography of ionogenic substances with nonpolar stationary phases / Cs.Horvath, W.Melander, J. Molnar // Anal. Chem. - 1977. - V.49. – N 21. – Р. 142-154. Шумская Н.Ю. Физико-химические закономерности удерживания производных адамантана в жидкостной хроматографии :Дис. ... канд. хим. наук : 02.00.04 Саратов, 2005. - 156 с.– [Электронный ресурс]. – режим доступа:http://www.dslib.net/fiz-xim.html.Пирогов А.В., Бендрышев А.А. и др. Определение жирорастворимых витаминов в зерновых премиксах, блендах, таблетированных биологически активных добавках и медпрепаратах методом ВЭЖХ // Заводская лаборатория. Диагностика материалов. – 2008. – Т. 74, № 3. – С.1 – 2.Шатц В.Д., Сахартова О.В. Высокоэффективная жидкостная хроматография: Основы теории. Методология. Применение в лекарственной химии. - Рига: Зинатне. - 1988. - 390 с. А.Ю. Петров, С.А. Дмитриченко, А.Л. Коваленко, Л.Е. Алексеева "Стандартизация препарата "Аданол" // Фармация - №5 - 2002 - с.11-13.М.А. Казьмин, А.В. Михалев, А.П. Арзамасцев "Определение компонентов препарата "БИЦИЛЛИН-3" методом ВЭЖХ" // Фармация - №5 - 2002 - с.5-6.Приложение 1Свойства растворителей для ВЭЖХРастворительПредел прозрачности для УФ-света. имЭлюирую-щая сила 0 на силикагелеПараметр Р’Параметр SГруппа селек-тивнос-тиА цетонитрил1900,505,83,1VIВода-1,5010,20,0VIIIГексан1900,010,1--Диоксан2150,454,83,5VIМетанол2050,75,13,011Метиленхлорид2330,323,1-VНропанол-22050,553,94,211Тетрагидро-фуран2120,444,04,4IIIТолуол2850,12,4-VIIТриэтиламин--1,9-IУксусная кислота--6,0-VIХлороформ2450,264,1VIIIЭтанол2100,64,3-3,6IIЭтилацетат2560,384,4VIПриложение 2Сорбенты для обращено-фазовой ВЭЖХСорбентSp, м2/гДиаметрпор, нмДиаметрчастиц, мкмФорма частицАдсорбсил С845065,10НерегулярнаяАдсорбсил С1845065,10НерегулярнаяАдсорбсфер С820083,5, 10СферическаяАдсорбсфер С1820083,5, 10СферическаяАлтима С8 105,10СферическаяАлтима С18 105,10СферическаяАльфаБонд С830012,55,10НерегулярнаяАльфаБонд С1830012,510НерегулярнаяМ-Бондопак С183001010НерегулярнаяМ-Бондопак Фенил3001010НерегулярнаяГиперсил С8170103,5, 10СферическаяГиперсил ОДС170103,5, 10СферическаяЗорбакс С835078СферическаяЗорбакс ОДС35078СферическаяДиасорб-130-С1300-350115, 7, 10НерегулярнаяДиасфер 130-С8300-350115, 7, 10СферическаяДиасфер-130-С18Т300-350115, 7, 10СферическаяЛихросорб RP-2300610НерегулярнаяЛихросорб RP 18300105,10СферическаяЛуна С18  3,5СферическаяЛуна С8  5СферическаяНуклеосил С18 103, 5, 7, 10СферическаяПартисил ОДС-3 510НерегулярнаяСепарон С18 105,10СферическаяСиласорб С2 105, 7, 10, 15,НерегулярнаяСиласорб С8 1020НерегулярнаяСиласорб С18 105, 7, 10, 15, 20НерегулярнаяСферисорб С18 105, 7, 10, 15, 20 СферическаяПриложение 3Детекторы для высокоэффективной жидкостной хроматографииВид детектораИзмеряемый параметрМинимально определяемое количество, гСелектив-ностьСпектрофото-метрическийОптическая плотность10-10ВысокаяФлуориметрическийИнтенсивность флуоресценции10-11ОченьКондуктометрическийЭлектропроводность10-9НизкаяАмперометрическийВеличину тока10-11-10-9ОченьМасс-спектрометрическийВеличину ионного тока10-12–10-10ОченьПриложение 4Условия проведения ВЭЖХ некоторых лекарственных средств [12]Продолжение приложения 6Приложение 5Выбор условий ВЭЖХ с учетом гидрофобности разделяемых веществ