Анализ лекарственных средств и форм, содержащих антибиотики (цефалоспорины)

Для водных растворов цефалексина характерны амфотерные свойства, которые обусловлены наличием в молекуле карбоксильной и алифатической аминогруппы. Поэтому для количественного определения цефалексина может использоваться метод неводного титрования. При этом в качестве растворителей используются муравьиная и ледяная уксусная кислота в смеси с ацетоном. Этим добиваются усиления основных свойств цефалексина, оттитровывают его диоксановым раствором хлорной кислоты.
Точка эквивалентности устанавливается потенциометрическим методом.
Цефалексин и другие цефалоспорины также могут быть определены с помощью фотометрического метода. В основе этой методики лежит способность образования окрашенных комплексов с ионом меди (II) и измерении светопоглощения при рН 6,55 в области 640-675 нм. В качестве реактива при этом выступает ацетат меди (II).
2.3 Фармакопейный контроль качества
Идентификация
К основным методам идентификации цефалоспоринов, относят согласно ИК-спектроскопию и, в случае натриевых солей, пробу на присутствие катиона натрия.
Идентификация ряда цефалоспоринов проводится с использованием метода ТСХ. В качестве неподвижной фазы используют силанизированный силикагель, который содержит флуоресцентный индикатор [9].
Подвижной фазой является смесь органического растворителя (ацетонитрила, ацетона, тетрагидрофурана, метилацетата) и водного раствора ацетата аммония (150 г/л), который доводят до рН 6,2 с помощью 5 М CH3COOH (табл. 6). Обнаружение пятен веществ проводится при помощи УФ-лампы (254 нм).

Таблица 6. Подвижные фазы, используемые для идентификации цефалоспоринов методом ТСХ
Вещества Органический растворитель и его соотношение (по объёму) с раствором ацетата аммония ЦЗ Ацетонитрил (15:85) ЦЛ, ЦТМ Ацетон (15:85) ЦФМ Тетрагидрофуран (10:90) ЦТА Метилацетат (10:90)
Идентификацию ряда цефалоспоринов используется также реакция с реактивом Марки, а также индивидуальные реакции, которые характерны для определённых цефалоспоринов (например, образование комплексного соединения оливково-зеленого цвета при действии на цефалексин сульфатом меди (II) в щелочной среде)
Испытания на чистоту
В ходе испытания на чистоту у цефалоспоринов определяют следующие показатели:
- прозрачность и цветность
- рН
- удельное вращение
- оптическую плотность
- родственные соединения
- содержание остаточных растворителей (N,N-диметиланилина, 2-этилгексановой кислоты)
- воду
- стерильность
- бактериальные эндотоксины
- сульфатную золу и тяжёлые металлы.
В табл. 7 показаны допустимые значения некоторых характеристик цефалоспоринов. Так, для большинства растворов цефалоспоринов характерна слабокислая или нейтральная среда (наименьшее допустимое значение рН у цефтазидима натриевой соли, в структуре которого имеется дополнительная карбоксильная группа; наибольшее – у цефуроксима натриевой соли), содержание воды минимально для цефуроксима аксетила, максимально для цефтазидима натриевой соли.

Таблица 7. Величина рН растворов, содержание воды и действующего вещества в субстанциях цефалоспоринов
Вещество Характеристики рН (концентрация г/л) Н2О (%) Основное вещество, % ЦЗ 4,0 – 6,0 До 6,0 95,0 – 102,0 ЦТ 4,5 – 7,0 1,5 96,0 – 101,0 ЦЛ 4,0 – 5,5 4,0 – 8,0 95,0 – 102,0 ЦП 4,5 – 6,5 5,0 96,0 – 102,0 ЦТМ 4,5 – 6,5 3,0 96,0 – 101,0 ЦФМ 5,5 – 8,5 3,5 96,0 – 102,0 ЦФМА - 1,1 96,0 – 102,0 ЦТА 6,0 – 8,0 8,0 – 11,0 96,0 – 102,0 ЦТД 3,0 – 4,0 13,0-15,0 95,0 – 102,0
Количественное определение
Главный метод количественного определения цефалоспоринов как в субстанции, так и в готовых лекарственных средствах – это метод ВЭЖХ. В качестве неподвижной фазы при определении цефалоспоринов данным методом может быть использован октадецилсиликагель (для большинства цефалоспоринов), а также гексил-силикагель (для цефуроксима, цефиазидима) и триметилсилилсиликагель (для цефуроксим аксетила) [1].
Подвижными фазами являются смеси ацето-нитрила или (и) метанола и водных буферных растворов (фосфатного, ацетатного, цитратного).
Детекцию проводят спектрофотометрически.
Количественное определение цефалоспоринов может также проводится с использованием УФ-спектрофометрия (можно использовать прямую спектрофотометрию, так как цефалоспорины достаточно интенсивно поглощают УФ-излучение), кислотно-основное титрование в неводных средах (количественное определение цефалексина в ГСО) и т.д.

Таблица 8. Условия количественного определения цефалоспоринов методом ВЭЖХ
Вещество НФ ПФ, скорость Детекция, нм ЦЗ С18-СГ Смесь (10:90) ацетонитрила и раствора, содержащего 2,77 г/л Na2HPO4 и 1,86 г/л лимонной кислоты (1 мл/мин) 270 ЦТ С18-СГ В 790 мл воды растворяют 17 г ацетата натрия и 0,6 мл ледяной уксусной ки- слоты (рН раствора 5,8–6,0), добавляют 150 мл ацетонитрила и 70 мл этанола (1 мл/мин, 40 °С) 254 ЦЛ С18-СГ Смесь (2:5:10:83) метанола, ацетонитрила, раствора KH2PO4 (13,6 г/л) и воды (1,5 мл/мин) 254 ЦП С18-СГ Смесь (884:110:3,5:2,5) воды, ацетонитрила, растворов уксусной кислоты (60 г/л) и ацетата триэтиламмония (1 мл/мин) 254 ЦТМ С6-СГ К раствору 3,5 г KH2PO4 и Na2HPO4 в 1000 мл воды (рН 7,0) прибавляют 180 мл метанола (1 мл/мин) 235 ЦФМ С18-СГ смесь (1:99) ацетонитрила и ацетатного БР (pH 3,4) (1,5 мл/мин) 273 ЦФМА Триметилселил-СГ смесь (38:62) метанола и раствора NH4H2PO4 (23 г/л) (1 мл/мин) 278 ЦТА С18-СГ растворяют 2 г тетрадециламмония бромида и 2 г тетрагептиламмония бромида в смеси 400 мл воды, 55 мл 0,067 М фосфатного БР (рН 7,0) и 5 мл цитратного БР (рН 5,0), разбавляют водой до 1000 мл и добавляют 500 мл ацетонитрила (1,5 мл/мин) 254 ЦТД С6-СГ К раствору 4,26 г Na2HPO4 и 2,73 г KH2PO4 в 980 мл воды добавляют 20 мл ацетонитрила (2 мл/мин) 245
2.4. Фармакопейный анализ цефалексина


Цефалексин
Cefalexinum
C16H17N3O4S
Описание. Антибиотик группы цефалоспоринов I поколения.
Белый или белый со слегка желтоватым оттенком порошок с характерным запахом.
Растворимость. Трудно и медленно растворим в воде, практически нерастворим в спирте.
Определение активности биологическим методом.
При определении активности биологическим методом общая активность препарата (сумма пенициллинов) не менее 96%. 
Подлинность.
1) На предметное стекло или в фарфоровую чашку, помещают 0,01 г препарата, прибавляют 1 каплю раствора, состоящего из 1 мл 1 н. раствора гидроксиламина гидрохлорида и 0,3 мл 1 н. раствора натрия гидроксида. Через 2-3 минуты к смеси добавляют 1 каплю раствора уксусной кислоты, тщательно перемешивают, затем добавляют 1 каплю раствора меди (II) нитрата (сульфата). Выпадаёт осадок зеленого цвета.
2) К 0,01 г препарата в пробирке прибавляют 1 мл концентрированной азотной кислоты и кипятят 2-3 минуты. После охлаждения добавляют 0,5 мл раствора бария хлорида. Выпадает белый осадок.
3) К 0,02 г препарата прибавляют 5 капель 1% раствора уксусной кислоты, 2 капли 1% раствора меди (II) сульфата и 1 каплю раствора натрия гидроксида. Появляется оливково-зеленое окрашивание.
4) К 0,01 г препарата добавляют 0,5 мл свежеприготовленного реактива Марки (2 капли раствора формальдегида в 0,5 мл концентрированной серной кислоты). Появляется бледно-желтое окрашивание. При нагревании наблюдается темно-желтое окрашивание.
Прозрачность и цветность раствора. 3% раствор препарата в воде для инъекций должен быть бесцветным и прозрачным в течение 24 часов при температуре не выше 10°.
рН раствора. 4,0 – 5,5
Содержание воды. 4,0-8,0
Содержание вещества. 95,0 – 102,0
Оптическая плотность водного 0,05%-ного раствора цефалексина при длине волны 330 нм должна составлять не более 0,05.
Количественное определение.
Количественное определение цефалексина выполняют спектрофотометрическим методом по собственному поглощению при длине волны 262 нм, используя в качестве растворителя и раствора сравнения воду. Расчет выполняют по стандартному образцу, светопоглощение которого измеряют в тех же условиях.















Заключение

В ходе работы была рассмотрена общая характеристика антибиотиков группы цефалоспоринов. Также были изучены основные химические и физические свойства цефалоспоринов, возможные реакции подлинности и идентификации. Были рассмотрены методы количественного определения цефалоспоринов.
Антибиотики являются веществами, которые синтезируются микроорганизмами и продуктами модификации этих веществ, избирательно подавляющие рост патогенных микроорганизмов, низших грибов, а также некоторых вирусов и клеток злокачественных новообразований.
Качественная идентификация антибиотиков, в отличие от ряда групп природных соединений (алкалоидов, гликозидов), не может проводиться с помощью общих, групповых реакций. Различные антибиотики дают ту или другую реакцию, преимущественно цветную.
Оценка качества антибиотиков, в том числе цефалоспоринов, проводится с помощью хроматографических методов (ВЭЖХ, ТСХ), спектроскопических методов (ИК-спектроскопия, УФ- спектроскопия), биологических методов, химических методов (идентификации с помощью химических реакций, количественное определение титриметрическими методами и т.д.).
Одним из важнейших методов анализа антибиотиклв, который используется как для идентификации, так и контроля чистоты и количественного определения, является ВЭЖХ.
Для идентификации цефалоспоринов также используют ТСХ и спектроскопические методы (ИК- и УФ-спектроскопию), а для количественного определения – УФ-спектроскопию.
Для количественного определения цефалоспоринов используют различные методы: биологические, химические, физико-химические.
Биологический метод основан на непосредственном биологическом действии антибиотика на применяемый тест-микроорганизм, который чувствителен к данному антибиотику.
Недостатком биологического метода контроля является затрата большого количества времени на анализ, а также зависимость точности результатов анализа от многих внешних факторов.
В последние годы широкое распространение для количественного определения цефалоспоринов получают химические и физико-химические методы, из которых наибольшее применение имеют фотоколориметрический и спектрофотометрический метод. Последние основаны на использовании определенных свойств антибиотиков: цветных реакций, появлении или исчезновении характерных полос в УФ- или ИК-областях спектра под действием различных реагентов (кислот, щелочей и др.).
















Список литературы

1. Арзамасцев А.П. Фармацевтическая химия. - М.: 1Э0ТАР-МЕД. 2004. - 640 с.
2. Беталактамные соединения. Взаимосвязь структуры и биологической активности / П.С. Ныс, В.Б. Курочкина, А.В. Скляренко, Г.А. Вейнберг // Антибиотики и химиотерапия. – 2000. – Т. 45, № 11. – С. 36 – 42.
3. Иваницкая Л.П. Направленный поиск природных беталактамных антибиотиков // Антибиотики. – 1983. – Т. 28, № 2. – С. 37 – 56. 3.
4. Кукес В.Г. Клиническая фармакология. - М: ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 1999. - 528 с.
5. Курочкина В.Б., Ныс П.С. Новые беталактамные структуры. Проблемы конструирования // Антибиотики и химиотерапия. – 2002. – Т. 47, № 2. – С. 29 – 37. 4.
6. Либинсон Г.С. Проблемы стандартизации антибиотиков. Устойчивость пенициллинов и цефалоспоринов в растворах // Антибиотики. – 1983. – Т. 28, № 2. – С. 56 – 75.
7. Машковский М. Д. Лекарственные средства. — М.; Медицина, 1998. 688 с.
8. Харкевич Л.Л. Фармакология. — М.: ГЭОТЛР-Медиа. 2006. - 736 с.
9. Руководство к лабораторным занятиям по фармацевтической химии. Под ред. Арзамасцева А.П. – М: Медицина, 2001. – 384с.
10. Determination of dissociation constants of cephalosporins by capillary zone electrophoresis / Y. Mrestani, R. Neubert, A. Munk, M. Wiese // J. Chromatogr. A. – 1998. – Vol. 803. – P. 273 – 278.
11. Optimization of separation and migration behavior of cephalosporins in capillary zone electrophoresis / C.E. Lin, H.W. Chen, E.C. Lin et al // J. Chromatogr. A. – 2000. – Vol. 879. – P. 197 – 210.
12. Péhourq F., Jarry C. Determination of third-generation cephalosporins by high performance liquid chromatography in connection with pharmacokinetic studies // J. Chromatogr. A. – 1998. – Vol. 812. – P. 159 – 178.















32