Особенности спектрофотометрического и физико-химических методов определения глюкокортикоидов

Методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) определяют наличие примесей стероидных гормонов в лекарственных веществах. Для этого на пластину наносят испытуемый раствор и стандартные образцы различных количеств стероидов, в том числе и глюкокортикоидов, примеси которых предпологают обнаружить (схема тонкослойной хроматографии представлена в приложении на на рисунке 3). Состав подвижной фазы образуют метанол, хлороформ, метиленхлорид и вода в разных соотношениях. Детекцию проводят в УФ-диапазоне (254 и 365 нм), в качестве проявителя может также выступать фосфорномолибденовая кислота(при установлении примесей в глюкокортикоидах), толуолсульфоновой кислотой и др. Методом ТСХ на пластинах Силуфол, Сорбфил, Кизельгель и других устанавливают во всех лекарственных веществах наличие примесей посторонних глюкокортикоидов. При проведении таких анализов на пластину наносят стандартные образцы с разными количествами стероидов, примеси которых предположительно могут содержаться в исследуемом препарате. Стандарты примесей наносят количественно.Состав элюента определяется в зависимости от конкретного препарата исследования. С помощью данного метода идентифицируют лекарственные препараты даже в случае наличия в них близких по структуре примесей, являющихся побочными продуктами синтеза. Методом ТСХ подтверждают подлинность ретаболила, дексаметазона, прогестерона, медроксипрогестерона ацетата в их лекарственных формах – идентификацию проводят по величине Rf в сравнении со стандартным образцом[3,9].Микроколоночный вариант ВЭЖХ используется для качественного анализа и испытаний на чистоту ряда глюкокортикоидов: кортизона ацетата, преднизолона ацетата и преднизолона. В аналитической практике применяют приборы с ультрафиолетовым детектором при 238 нм. Данный метод позволяет количественно определять наличие примесей. Метод колоночной хроматографии используют для определения веществ стероидной природы в сложных биологических средах, но широкое применение данная методика нашла и для разделения стероидов в фармакологической практике. Метод ВЭЖХ в прямофазном и обращеннофазном вариантах используется для количественной оценки преднизолона и гидрокортизона ацетата в мазях.Стероиды - это соединения средней полярности, поэтому для их разделения применяется широкий спектр адсорбентов (оксид алюминия, силикагель, силикат магния)и растворителей.Важным этапом в колоночной хроматографии для анализа стероидов стало введение гель-проникающей хроматографии, которую используют при пробоподготовке биологических образцов для количественного анализа методами газовой хроматографии. Для разделения и очистки стероидов с близкой и выраженной полярностью применяют сефадекс LH-20, для менее полярных стероидов используютоксиалкоксипропил-производные сефадекса LH-20. На рисунке 4 (приложение) показано разделение стероидов на колонке с липидексом [5].Распределительная жидкость-жидкостная хроматография использовалась уже в ранний период развития хроматографии стероидов и применяется в фармацевтике по настоящее время.Глава 4 Практическая часть4.1 Анализ УФ-спектровСпектры снимали в 95% этаноле, потому что стероидные вещества вследствие их гидрофобобности обладают хорошей растворимостью в органических растворителях.УФ-пик поглощения кортизона находится в области длины волны 238-242 нм (приложение, рисунок 5). У эстрона и эстрадиола пики лежат в области 280 нм (приложение, рисунок 6). Смещение происходит за счет влияния ароматической системы (в кольце А), сопряженной с неподелённой парой электронов. У преднизолона в кольце А π-система представлена двумя двойными связями и одной кетогруппой, плюс кетогруппа имеется в кольце С. Наличие двойных связей (кетогруппа) несопряженных с основной π-системой кольца А влияет на высоту пика, поэтому у преднизолона пик выше, чем у кортизона (приложение, рисунок 7).4.2 Анализ ИК-спектровПреимуществом метода инфракрасной спектрометрии по сравнению с ультрафиолетовой спектрофотометрией является то, что спектры даже в наименьшей степени замещенных производных относительно богаты характерными полосами поглощения, что дает возможность анализировать даже сложные смеси стероидов без предварительной подготовки и разделения. Из недостатков метода: малая чувствительность, обусловливающая в большинстве случаев необходимость концентраций исследуемых растворовв пределах нескольких процентов. При таких концентрациях могут происходить внутримолекулярные взаимодействия, и поэтому всегда нужно тщательно проверять подчинимость закону Бугера-Ламберта-Бера.Другая трудность состоит в том, что для количественных анализов оптические плотности нельзя измерять непосредственно - их оценивают по методике базисной линии. Поэтому у метода инфракрасной спектрометрии более низкая воспроизводимость, чем у методаультрафиолетовой спектрофотометрии.В спектрах кортизона, преднизолона и иных стероидов, кроме прогестерона существует интенсивный пик при 3400-3200 см-1, обусловленный валентными колебаниями гидроксигруппы [10,11]. В спектрах кортизона, преднизолона, дексаметазона (приложение, рисунок 8) и эстрадиола (приложение, рисунок 12) пик широкий, в отличие от спектра эстрона (приложение, рисунок 9) и прегнина, что объяснимо наличием не одной, а нескольких гидроксигрупп у кортизона, преднизолона, дексаметазона и эстрадиола.Т.е, по этому признаку (ширина пика) можно определять, является ли анализируемое вещество стероидом с одной или несколькими гидроксигруппами.У прогестерона (приложение, рисунок 10) описываемый пик отсутствует вследствие отсутствия гидроксигруппы, и таким образом можно отличить прогестерон от всех других стероидов.В спектрах кортизона, преднизолона (приложение, рисунок 11) и иных стероидов кроме эстрадиола наблюдается интенсивный пик 1650-1750 см-1[12], обусловленный валентными колебаниями кетогруппы, в спектрах кортизона, преднизолона (приложение, рисунок 11), дексаметазона (приложение, рисунок 8) расщепленный из-за резонанса нескольких кетогрупп.Кетогруппа у эстрадиола отсутствует, поэтому у него данный пик не появляется. Так можно отличить эстрадиол в смеси с другими стероидами.Таким образом наличие функциональных групп позволяет отличать вещества стероидной природы, проводить их идентификацию, а также количественный анализЗаключениеГлюкокортикоидные гормоны являются производными прегнана.Для обнаружения стероидного цикла в исследуемом веществе применяют реакцию образования флуоресцирующих или окрашенных соединений при взаимодействии с концентрированной серной кислотой. α-кетольную группу обнаруживают за счет проявления ее восстановительных свойств, кетогруппу открывают по реакции формирования кетоксимов при взаимодействии с гидроксиламином, а также гидразонов — с фенилгидразином и прочими гидразинами и гидразидами. Описанные выше химические реакции используют для количественного анализа стероидных веществ фотоколориметрическими методами. Аналитическая практика испытаний на подлинность и количественный анализ веществ стероидной природы включает и ряд методик ультрафиолетовой-спектрофотометрии.Применяют для анализа также ИК-спектрометрию и хроматографический метод.ЛитератураБеликов В.Г. Фармацевтическая химия: учебник / В.Г. Беликов. - 4-е изд., перераб. и доп.– М.: МЕДпресс-информ, 2007. - 621 с.Малкин П.А. Молекулярная фармакология глюкокортикоидов на основе природных и синтетических структур Дисс. на соиск. уч. степ. канд. мед. наук . - М. 2014.Александрова, Э.А. Аналитическая химия в 2 кн. Кн. 2. Физико-химические методы анализа: Учебник и практикум / Э.А. Александрова, Н.Г. Гайдукова. - Люберцы: Юрайт, 2016. - 355 c.И. М. КоренманИ11 Фотометрическийанализ. Методы определения органических соединений /. И. М. Коренман – М.: Книга по Требованию, 2012.Алексеев К.В. Фармацевтическая технология/ К.В.Алексеев, С.Н. Суслина - Ростов-на-Дону: Феникс, 2016. – 411.Писарев Д.И. Оптимизация методов контроля качества лекарственных препаратов стероидной структуры на примере глюкокортикостероидов /Д.И. Писарев, О.О. Новиков, И.В. Корниенко // Научный результат. Серия Медицина и фармация. 2015. – Т.1 №4(6). Титова А.В. Применение ближней инфракрасной спектрометрии в фармацевтическом анализе / А.В Титова, Н.П. Садчикова, К.С. Балыклова // Научно-практический журнал: Разработка и регистрация лекарственных средств - №6, 2014.Васильева В. И. Спектральные методы анализа. Практическое руководство / Васильева В. И. [и др.]; под ред. В. Ф. Селеменева, В. Н. Семенова. - Лань, 2014. - 416 с.Смирнов В.А. Анализ лекарственных средств. Определение общих технологических примесей в лекарственных веществах: учеб. пособ. Ч. II. / В.А. Смирнов. - Самара: Самар. гос. техн. ун-т, 2008. - 66 с.Раменская Г.В. Фармацевтическая химия:учебник для вузов/ Г.В. Раменская М:Бином. - 2015. - 472 с.Сливкин А.И. Атлас ИК-спектров лекарственных веществ. А.И. Сливкин, О.В. Тринеева, Е.Е. Логвинова, А.С. Чистякова, Л.Ю. Яковлев, И.И. Механтьев. Издат.-полиграф. центр Воронежского государственного университета - 2013.- 172 с. Лигостаев А.В. Спектрофотометрическое определение преднизолона и циклофосфана// Сибирский медицинский журнал.- 2013.- том 25.ПРИЛОЖЕНИЕРисунок 1 - УФ – Спектры ненасыщенных 3 – кетостероидов в метаноле1 – содержащих Δ4-3-кетогруппу, 2 – содержащих Δ1,4-3-кетогруппу, 3 – содержащих Δ4,6-3-кетогруппу Рисунок 2 - УФ – спектры метанольных экстрактов масляных препаратов для инъекций, содержащих прогестерон и бензоат эстрадиола1 – спектр полученный сразу после экстракции, 2 –дифференциальный спектр (раствора невосстановленного соединения относительно восстановленного борогидридом натрия), 3 –спектр раствора восстановленного соединенияРисунок 3 – Схема тонкослойной хроматографииРисунок 4 - Разделение стероидов на небольшой колонке (8 см*0,4 см) с липидексомРисунок 5 – УФ-спектр кортизонаРисунок 6 – УФ-спектр эстрадиолаРисунок 7 – УФ- спектр преднизолонаРисунок 8 – ИК- спектр дексаметазонаРисунок 9 - ИК -спектр эстронаРисунок 10 – ИК- спектр прогестеронаРисунок 11- ИК спектр преднизолонаРисунок 12 - ИК-спектр эстрадиола