Эндотелий: строение, функции, способы регуляции функционирования

В то время как некоторые среды дополнены отдельными рекомбинантными факторами роста, такими как EGF (эпидермальный фактор роста, англ. epidermal growth factor), FGF2 (фактор роста фибробластов 2, англ. fibroblast growth factor 2), VEGF (сосудистый эндотелиальный фактор роста, англ. vascular endothelial growth factor) и IGF1 (инсулиноподобный фактор роста 1, англ. insulin-like growth factor 1), другие среды содержат комбинированные добавки ECGS (добавка для роста эндотелиальных клеток, англ. endothelial cell growth supplement), которые производятся из бычьего мозга – BBE (экстракт бычьего мозга, англ. bovine brain extract), гипофиза – BPE (экстракт бычьего гипофиза, англ. bovine pituitary extract) или гипоталамуса – BHE (экстракт бычьего гипоталамуса, англ. bovine hypothalamus extract), богатые веществами, способствующими росту и пролиферации эндотелиальных клеток. Помимо факторов роста, среда для культивирования эндотелиальных клеток может быть дополнена гидрокортизоном, может содержать Lглютамин, гепарин, аскорбиновую кислоту и циклический аденозинмонофосфат (АМФ). Поскольку рост, пролиферация, жизнеспособность и дифференцировка эндотелиальных клеток регулируются эндокринными факторами, все перечисленные процессы могут модулироваться питательными средами и добавками [16]. In vivo пролиферация клеток ограничена эмбриональным и плацентарным развитием, а также некоторыми процессами, протекающими во взрослом организме. Для эндотелиальных клеток основным состоянием является пресинтетическая G0 фаза клеточного деления или состояние покоя. Следовательно, во время культивирования in vitro в питательной среде должны содержаться вещества, стимулирующие пролиферацию – ростовые факторы.Примером работы с эндотелиальными клетками в рутинной лабораторной работе может служить культивирование клеток, как артериального, так и венозного происхождения, в плотности не менее 104 кл/см2 в ростовой среде (например, DMEM/F12 (среда Игла в модификации Дульбекко с добавлением питательных веществ (F-12), англ. Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12) – или 199) с добавлением L-глутамина, 1% пенициллина/ стрептомицина, HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота, англ. (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid), NaHCO3, факторов роста VEGF, EGF, bFGF, гепарина и эмбриональной (фетальной) телячьей сыворотки. В своей ежедневной лабораторной работе мы, как правило, используем следующую ростовую среду для работы с эндотеолиоцитами как венозного, так и артериального происхождения до достижения искомой конфлюэнтности (70-80%): среда DMEM/F12, 10% фетальная бычья сыворотка, пенициллин-стрептомицин 100мг/мл, факторы роста VEGF 3 нг/мл, EGF 0.4 нг/мл, FGF 10 нг/мл, 1% раствор Glutamax (рис. 2.1).Рис. 2.1. Пример 2 D культивирования. Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) в двумерной монослойной культуре in vitro. Ув. × 200. Лаборатория клеточных технологий ЦНИЛУдобной альтернативой для рутинной работы могут служить готовые ростовые среды для эндотелия, такие как ECGM (англ. Endothelial Cell Growth Medium, Cell Applications), либо добавки к базовой среде в виде бычьего питуитрального экстракта BPE. Процедуру замены среды осуществляют раз в одни-двое суток, культуры пассируют с использованием 0,25% раствора трипсина в плотности 100тыс.кл./см2. Помимо факторов роста, таких как VEGF, FGF, EGF, условий атмосферы, субстрата и т.д. большое значение для роста клеток в культуре имеет микрорельеф культуральной поверхности, а также тип и плотность лигандов, участвующих в образовании фокальных адгезий. В условиях in vitro соотношение клеточных контактов, которое в организме определяется внеклеточным матриксом и субстратом, при 2D культивировании в монослое нарушается, что в итоге приводит к изменению морфологии и функциональных характеристик большинства клеточных культур, в том числе и эндотелия [29].2.3. Особенности культивирования эндотелиальных клеток в 3D условияхПоскольку межклеточные взаимодействия играют решающую роль в регуляции клеточной физиологии, в попытках воссоздать наиболее оптимальные условия роста, дифференцировки, пролиферации и адгезии клеток были исследованы различные компоненты межклеточного матрикса. Для этого эндотелиоциты высевали в стандартные колбы для тканевых культур или на коллаген I типа, фибронектин, ламинин, и выращивали в среде с низким содержанием сыворотки, содержащей различные факторы роста, включая bFGF, EGF или ECGS. Клетки, выращенные на коллагене I типа в течение пяти-семи дней, показали увеличение числа клеток в двачетыре раза по сравнению с клетками, посеянными на пластик, ламинин или фибронектин. Митогенный эффект коллагена I был максимальным, когда EGF, ECGS и гепарин были включены в оптимизированную среду с низким содержанием сыворотки. Однако для индукции дифференцировки оптимальными внеклеточными матрицами ECM (англ. extracellular matrices) были либо фибронектин, либо Corning Matrigel® Matrix, восстановленная базальная мембрана. Приближение условий культивирования in vitro к микроокружению in vivo способствует увеличению роста и дифференцировки клеток, поддержанию их естественной морфологии [31].В настоящее время развиваются технологии трехмерного культивирования клеток (3D), в которых, в отличие от монослойного (2D) культивирования, клетки растут либо в трехмерном окружении, либо внутри матрикса или каркаса с трехмерной архитектурой [11]. Трехмерные условия культивирования гораздо ближе к нативным условиям, чем выращивание клеток в традиционных фласках или чашках Петри с плоским дном (2D). В живых организмах питание клеток и тканей обеспечивает обширная капиллярная сеть, которая формируется в процессе развития. Перфузионная система также необходима для формирования тканей in vitro для создания конструктов клинически значимых размеров [33]. Основной проблемой 3D культивирования является обеспечение доставки питательных веществ и кислорода к клеткам. Формирование трубчатых сетей осуществляется различными методами. Одним из них является использование коллагеновых гелей животного происхождения (коллагеновое сырье I типа хвостов крыс). Для этого эндотелиоциты диспергируют в трехмерном коллагеновом геле, подвергают воздействию ростовых факторов в присутствии низкого уровня сыворотки. В этих условиях клетки организуются в течение 48 часов в сеть тонкостенных трубок, которые очень похожи на нативные капилляры [12].Таким образом, при использовании технологии 3D культивирования с правильно подобранными составом, структурой и механическими свойствами клетки могут формировать ткани и органоподобные структуры, повторяющие структуру и функции органа [14]. На сегодняшний день широко используется технология 3D культивирования на матрице под названием Матригель (англ. Matrigel™), которая представляет собой внеклеточный матрикс, получаемый как продукт культивирования опухолевых клеток саркомы линии Энгельберта-Хольма-Сворма EHS (англ. Engelbreth-Holm-Swarm). Выпускается в двух видах – содержащий факторы роста (англ. BD Matrigel™ Basement Membrane Matrix) и лишенный факторов роста (англ. Matrigel® Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix). Выбор конкретного вида матригеля зависит от целей проводимого эксперимента. При использовании Матригеля эндотелиоциты начинают образовывать тубулярные структуры с образованием капиллярного просвета и плотных контактов между клетками, что позволяет изучать особенности ангиогенеза в условиях in vitro (рис. 2.2).Также существует протокол ведения 3D культур, основанный на образовании «сэндвича» из матригеля. Метод заключается в формировании слоистой структуры: сначала формируют нижний слой – заливают дно культуральной посуды матригелем, затем на нижний слой высевают культуру клеток, после добавляют верхний слой – смесь матригеля и среды для роста [27]. Альтернативой использованию Матригеля может выступать матрица Джелтрекс (англ. Geltrex™) – растворимая форма базальной мембраны, выделенная из опухолей линииРис. 2.2. Пример 3D культивирования. Образование капилляроподобных структур (тубулогенез) в культуре эндотелиальных клеток HUVEC на матригеле, лишенном факторов роста. Ув. × 200. Лаборатория клеточных технологий ЦНИЛ EHS.Основные компоненты матрицы Geltrex™ включают в себя ламинин, коллаген IV, энтактин, гепарансульфат и протеогликаны. Она предназначена для роста и поддержания дифференцированных фенотипов в различных клеточных культурах, включая первичные эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки, клетки гладких мышц и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки [4].Несмотря на то, что проверенная временем 2D культура клеток оказалась ценным методом для клеточных исследований, ее ограничения все чаще признаются. 2D клеточная культура не позволяет учитывать естественное трехмерное окружение клеток. В результате данные, которые получаются при изучении 2Dклеточных культур, в ряде случаев могут давать недостоверные результаты по сравнению с условиями 3D и in vivo. Системы 3D-культивирования клеток имеют более высокую степень организации, что приближает их к естественным условиям существования эндотелиальных клеток [3].При переходе от 2D к 3D культивированию одним из очевидных изменений является наличие механической среды, которая имеет важное значение для клеточной адгезии, распространения, миграции и дифференцировки клеток. Трехмерные модели позволяют создавать определенные условия миграции и проникновения различных веществ. Клетки в 3D культуре морфологически и физиологически отличаются от клеток в 2D культуре. Именно дополнительная размерность трехмерных культур является критической характеристикой, приводящей к различиям в клеточных реакциях, поскольку она не только влияет на пространственную организацию рецепторов клеточной поверхности, участвующих во взаимодействиях с окружающими клетками, но также вызывает физические ограничения для клеток. Эти пространственные и физические аспекты в трехмерных культурах влияют на передачу сигнала снаружи внутрь клетки и в конечном итоге влияют на экспрессию генов и поведение клеток. Большинство двумерных методов не могут поддерживать форму клетки, которая определяет биофизические сигналы, влияющие на активность клеток in vivo. 3D методы обеспечивают равномерный доступ питательных веществ и факторов роста, присутствующих в среде, что приводит к гомогенному росту и пролиферации. Жидкая среда в традиционной 2Dкультуре клеток не всегда позволяет поддерживать желаемые концентрации и градиенты факторов роста [19].Переход от рутинного 2D культивирования к 3D моделям является многообещающим, но возможность рутинного применения технологии и более высокая стоимость по-прежнему являются главными ограничениями в реализации этого перехода. Требуется дальнейшая работа для обеспечения оптимальных воспроизводимости, методов считывания и автоматизации данных для создания стандартизированных и проверенных трехмерных моделей клеточных культур.ЗаключениеЭндотелий – эволюционно выработанный специализированный клеточный тип с присущими только ему характерными функциями. В процессе онтогенеза стенка первичных сосудов дифференцируется в различных направлениях и создает своеобразно устроенную сосудистую структуру, обеспечивающую специфику функционирования органа. Результатом онтогенеза становится артериальновенозная и лимфатическая специализация с возникновением сосудов основных систем циркуляции: артериальной, венозной и лимфатической.Морфологические и функциональные особенности, присущие эндотелию, необходимы для выполнения ряда специфических функций, направленных на оптимальное приспособление к условиям гемодинамики и метаболизма, регуляции перфузии, гемостаза, коагуляции, реакций воспаления, новообразования сосудов и подержания гомеостаза. Изучение эндотелия в условиях in vitro является одним из ключевых направлений в медицинской биологии в поиске новых подходов к лечению широкого спектра заболеваний, в первую очередь, сердечно-сосудистых.В целом, эндотелиальная функция можетбыть определена как баланс противоположно действующих начал – релаксирующих и констрикторныхфакторов, антикоагулянтных и прокоагулянтных факторов, факторов роста и их ингибирования и т.д., а эндотелиальная дисфункция – нарушение равновесияуказанных противоположно действующих начал, нарушающих гемоваскулярный гомеостаз. Ключевым моментом в дисфункцональном состоянии эндотелия является недостаточная продукция оксида азота.Барьерную функцию эндотелия обеспечивает тесная взаимосвязь морфофункционального состоянии гликокаликса и активности трансцеллюлярного и парацеллюлярного механизмов транспорта.На регуляцию функций эндотелия оказывают влияние ряд факторов, основными из которых являются: Проблема нарушения функционального состояния сосудистого эндотелия не утратила своей актуальности, что объясняется не только обширностью спектра заболеваний, с которыми ассоциирована дисфункция эндотелия, поразительным многообразием процессов, находящихся под контролем сосудистого эндотелия, но и тем, что в сфере исследования механизмов, лежащих в основе нарушения функционального состояния сосудистого эндотелия, все еще остаётся значительное число неизученных вопросов, в том числе касающихся аллергодерматозов.Работа с эндотелиальными клетками in vitro позволяет проводить специфичные, доступные и подробные исследования различных заболеваний сердечно-сосудистой системы. Несмотря на все достоинства, данный вид исследований имеет ограничения, главным из которых является сложность сопоставления результатов изучения патологических состояний в рамках лабораторной работы и оценки биологии целого организма в естественных физиологических или патологических условиях. Поэтому чрезвычайно важно продолжить оптимизировать in vitro методики работы с эндотелиальными клетками различного происхождения, в том числе от индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, что позволит разрабатывать и применять последовательные надежные процедуры экстраполяции результатов in vitro исследований в условия in vivo.Список используемой литературыБелокопытова, И.С. Диагностическое значение молекул адгезии sICAM-1 и sVCAM-1 при ишемической болезни сердца / И.С. Белокопытова [и др.] // Атеросклероз и дислипидемии. 2013. №4. С. 62-65.Бобрик, И.И.Развитие кровеносных и лимфатических сосудов/ И.И.Бобрик, Е.А.Шевченко, В.Г.Черкасов. – Киев; 2018. – 364 с.Волкова, О.В., и возрастная гистология внутренних органов человека/ О.В.Волкова, М.И.Пекарский. –М.; 1976.Гурина, О.Ю.Развитие сосудистого эндотелия в раннем периоде эмбриогенеза млекопитающих / О.Ю.Гурина, Е.Р.Павлович, Г.В. Ставицкая // Успехи современного естествознания. – 2010. – №9. – С. 129-131.Дорофиенко, Н. Н. Роль сосудистого эндотелия в организме и универсальные механизмы изменения его активности (обзор литературы) / Н.Н.Дорофиенко // Бюл. физ. и пат. дых. – 2018. – №68. [Интернет-ресурс] – URL: https://cyberleninka.ru/article/n/rol-sosudistogo-endoteliya-v-organizme-i-universalnye-mehanizmy-izmeneniya-ego-aktivnosti-obzor-literatury (дата обращения: 22.11.2020).Иванов, А.Н. Барьерная функция эндотелия, механизмы ее регуляции и нарушения / А. Н. Иванов, Д. М. Пучиньян, И. А. Норкин // Успехи физиологических наук. – 2015. – Т. 46, № 2. – С. 72–96Иванов, А.Н.Структурные особенности эндотелиальных клеток млекопитающих и человека / А.Н.Иванов, И.О.Бугаева, М.О. Куртукова // Цитология. – 2016. – Т. 58, №9. – С. 657-665.Каде, А.Х. Физиологические функции сосудистого эпителия /А.Х.Каде [и др.] // Фундаментальные исследования. – 2011. – № 11. – С. 611-617.Калинин, Р.Е.Варианты экспериментального моделирования венозной эндотелиальной дисфункции: современное состояние проблемы / Р.Е.Калинин [и др.] // Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова. 2014. №3. С. 143-146.Калинин, Р.Е.Генная индукция ангиогенеза у неоперабельных пациентов с атеросклерозом и сахарным диабетом / Р.Е.Калинин [и др.]// Ангиология и сосудистая хирургия. – 2018. – Т. 24, №2. – С. 33-40.Калинин, Р.Е. Дисфункция эндотелия у пациентов с имплантируемыми сердечно-сосудистыми электронными устройствами (обзор литературы) / Р.Е.Калинин [и др.]// Наука молодых (Eruditio Juvenium). – 2016. – №3. – С. 84-92.Коненков, В.И.Ангиогенез и васкулогенез при сахарном диабете: новые концепции патогенеза и лечения сосудистых осложнений / В.И.Коненков, В.В. Климонтов // Сахарный диабет. 2012. №4. С. 17-27.Корчагина, А.А.Роль рецепторов VEGFR в неопластическом ангиогенезе и перспективы терапии опухолей мозга / А.А.Корчагина [и др.] // Вестник Российской академии медицинских наук.– 2013.– Т. 68, №11. – С. 104-114.Куприянов, В.В.Ангиогенез: образование, рост и развитие кровеносных сосудов / В.В.Куприянов [и др.]. М.; 1993.Лупинская, З.А. Эндотелий сосудов-основной регулятор местного кровотока / З.А.Лупинская // Вестник КРСУ. – 2003. – Т. 3, №7. – С. 1-10.Мнихович, М.В. Морфогенетические механизмы клеточных взаимодействий в процессе ангиогенеза (лекция) / М.В.Мнихович [и др.]// Журнал анатомии и гистопатологии. – 2012. – Т. 1, №3.– С. 53-65.Парфенова, Е.В.,. Терапевтический ангиогенез: достижения, проблемы, перспективы / Е.В.Парфенова, В.А. Ткачук // Кардиологический вестник.–2007. – Т.2, №2. – С. 5-14.Повещенко, О.В.Физиологические и цитологические основы клеточной регуляции ангиогенеза / О.В.Повещенко, А.Ф.Повещенко, В.И. Коненков // Успехи физиологических наук. 2012. Т. 43, №3. С. 48-61.Повещенко, О.В.Эндотелиальные прогениторные клетки и неоваскулогенез / О.В.Повещенко, А.Ф.Повещенко, В.И. Коненков // Успехи современной биологии. –2012. –Т. 132, №1. –С. 69-76.Руководство по гистологии / Под ред.Р.К.Данилова.– СПб.; 2011. Семенова, А.Е.Роль эндотелиальных прогениторных клеток при атеросклерозе/ А.Е.Семенова [и др.] // Атеросклероз и дислипидемии. – 2012. – №3. – С.14-24.Степаньянц, С. Д. Гидра: от Абраама Трамбле до наших дней / С. Д.Степаньянц, В.Г.Кузнецова, Б.А. Анохин. – М.СПб.; 2003.-522 с.Табаров, М.С., Тоштемирова З.М., Саидмурадова Р.А., и др. Физиология и патология эндотелия / [и др.] // Вестник Авиценны. 2012. №2. С. 196-201.Умарова, З.Д. Типы эндотелия сосудов / З.Д. Умарова, З.Д. Зияева, Т.А. Камалов // Медицинская наука XXI века – взгляд в будущее: сб. тр. междунар. научн. – практ. конф. – Т. III. – Душанбе, 2019.. – С. 290.Черешнев, В.А.Клиническая патофизиология / В.А.Черешнев, П.Ф.Литвицкий, В.Н.Цыган. – СПб.; 2015.Чернышев, А. В. Сравнительная морфология, систематика и филогения немертин / А.В. Чернышев. – Владивосток; 2011. – 244 с.Chistiakov D.A., Orekhov A.N., Bobryshev Y.V. Endothelial PECAM-1 and its function in vascular physiology and atherogenic pathology // Experimental and Molecular Pathology. 2016. Vol. 100,№3. P. 409-415.DeLeve L.D., Maretti-Mira A.C. Liver Sinusoidal Endothelial Cell: An Update // Semin. Liver Dis. 2017. №4. P. 377-387.Gao Y. Endothelium-Derived Factors. In: Biology of Vascular Smooth Muscle: Vasoconstriction and Dilatation. Singapore; 2017.Goligorsky M.S., Kuo M-C., Patschan D. Endothelial progenitor cells in renal disease // Nephrology. 2009. Vol. 14, №3. P. 291-297.Privratsky J.R., Newman P.J. PECAM-1: regulator of endothelial junctional integrity // Cell and Tissue Research. 2014. Vol. 355, №3. P. 607-619.Sadler J.E. Biochemistry and genetics of von Willebrand factor // Ann. Rev. Biochem. 1998. Vol. 67. Р. 395-424.Schatteman G.C., Dunnwald M., Jiao C. Biology of bone marrow-derived endothelial cell precursor// Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2007. Vol. 292, №1. P. 1-18. doi:10.1152/ajpheart.00662.2006Tkachenko E., Tse D., Sideleva O. et al. Caveolae, fenestrae and transendothelial channels retain PV1 on the surface of endothelial cells // PLoS One. 2012. Vol. 7, №3. P.e32655.Vestweber D. VE-cadherin: the major endothelial adhesion molecule controlling cellular junctions and blood vessel formation //Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2008. Vol. 28, №2. P. 223-232.Zhang D., Yuan D., Shen J., et al. Up-regulation of VCAM1 relates to neuronal apoptosis after intracerebral hemorrhage in adult rats // Neurochemical Research. 2015. Vol. 40, №5. P. 1042-1052.