Современные методы диагностики инфекционных болезней собак

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — метод ферментативного получения ампликонов (большого количества копий) изучаемых фрагментов ДНК путем повторных циклов репликации и денатурации (разделение цепи ДНК на отдельные нити); в этом случае копируется только исследуемый участок ДНК (при условии, что он присутствует в данном образце), так как только этот участок удовлетворяет заданным условиям.
Метод ПЦР идеально подходит для обнаружения микроорганизмов, которые трудно визуализировать, медленно расти или трудно культивировать. ПЦР является наиболее предпочтительным методом диагностики заболевания в остром периоде. Основным ограничивающим фактором применения ПЦР является содержание в исследуемом образце достаточного количества материала (нуклеиновой кислоты возбудителя). Для многих возбудителей известно, что их количество в крови меняется во времени; таким образом, в какой-то момент ПЦР может показать ложноотрицательный результат у инфицированного пациента. Таким образом, врачу крайне важно знать тропность возбудителя к тканям организма и направить на исследование тот материал, в котором вероятность обнаружения возбудителя наиболее высока (например, моча - при диагностике лептоспироза, плаценты или пунктата яичка при подозрении на бруцеллез, синовиальной жидкости - при исследовании на боррелиоз).
К техническим недостаткам этого метода можно отнести возможность получения ложноотрицательных результатов из-за наличия в образце ингибиторов реакции, а также возможность получения ложноположительных результатов из-за контаминации. Кроме того, этот метод не всегда подходит для оценки эффективности лечения, так как ПЦР выявляет как живые микроорганизмы, так и их «остатки» [2, 3].
Серологические методы диагностики.
Эти методы основаны на обнаружении специфических антител у животных. Заражение инфекционным агентом, если оно происходит впервые, в течение недели вызывает умеренное повышение иммуноглобулинов класса М (IgM) у животного и постепенное повышение иммуноглобулинов класса G (IgG), которое достигает пика через 14 дней. . Определение уровней антител у животных с острым началом заболевания (например, бабезиозом) дает мало полезной диагностической информации. Для диагностики хронических заболеваний (например, моноцитарного эрлихиоза) более полезным будет измерение уровня антител.
Производство антител у каждого животного может сильно различаться; этот процесс зависит от возраста, иммунного статуса и генетической принадлежности. Лучшим способом оценки степени сероконверсии является исследование парных сывороток, взятых с интервалом 2-3 недели. Повышение титра антител указывает на недавнюю и, следовательно, клинически значимую инфекцию, особенно если это подтверждается соответствующими клиническими признаками. Альтернативным методом определения недавнего заражения является измерение уровня IgM, но в ветеринарной практике этот метод практически не применяется.
1) Иммуноферментный анализ (ИФА).
Принцип метода заключается в иммобилизации одного из специфических реагентов (антигена) на твердой фазе. Затем последовательно добавляют другие специфические реагенты, промывая после инкубации каждого из них для удаления несвязавшихся компонентов. Один из специфических реагентов, так называемый конъюгат, содержит ферментную метку. Для визуализации результата в конце реакции добавляют хромогенный субстрат. Через определенный промежуток времени реакцию останавливают и проводят отсчет на спектрофотометре.
Для определения титра антител в сыворотке готовят несколько серийных разведений; титр антител определяется как величина, обратная последнему кажущемуся разведению (например, если последнее разведение было 1:2000, то титр антител будет равен 2000). Твердофазный ИФА является наиболее предпочтительным методом определения наличия антител к возбудителям, антигены которых легкодоступны (т. е. это либо легко культивируемые микроорганизмы, либо те, для которых получены рекомбинантные антигены). Кроме того, его можно использовать и для выявления антигенов возбудителя — например, при диагностике инвазии Dirofilaria immitis или вируса кошачьей лейкемии.
Для использования полноценного иммуноферментного анализа необходимо специальное лабораторное оборудование. Однако существует экспресс-модификация ИФА (SNAP, IDEXX Laboratories), где антиген/антитела иммобилизуют не на планшете, а на мембранном фильтре. Эти тесты широко используются в клиниках для диагностики трансмиссивных болезней (лейшманиоз, дирофиляриоз, анаплазмоз, эрлихиоз и боррелиоз). Однако они не позволяют зафиксировать повышение или снижение титра антител, а также определить, относятся ли они к классу М или G.
2) Метод флюоресцентных антител (МФА).
В случае, когда культивирование микроорганизма связано с техническими трудностями или небезопасно, применяют метод иммунофлуоресценции. В этом случае он может быть обнаружен как сам организм в инфицированных клетках и тканях больного (прямой МФА) или наличие специфических антител в сыворотке крови (непрямой МФА). При непрямом МФА инфицированные клетки (обычно культурального происхождения) фиксируют на предметных стеклах или планшетах. Сама процедура исследования аналогична таковой в ИФА. Однако в конъюгате вместо фермента здесь используется специальный краситель, дающий флуоресцентное свечение на определенной длине волны, что можно увидеть в специальный микроскоп. Количество антител определяют также по последнему разведению, давшему положительный результат.
Прямой МФА считается менее чувствительным; применяют при небольшом количестве инфицированных клеток (например, для выявления Anaplasmaphagocytophilum morulae в мазках крови).
3) Иммуноблот (вестерн-блот).
Это метод, при котором можно визуализировать взаимодействие антител с каждым антигеном отдельно. Антигены возбудителя отделяют друг от друга электрофорезом, а затем наносят в виде полос на специальную мембрану (обычно нитроцеллюлозную). Дальнейшие этапы аналогичны таковым в ИФА. Для определения результатов обычно используется иммунопероксидазный метод; при этом комплексы антиген-антитело визуализируются в виде отдельных темных полос. Таким образом, можно понять, к каким именно антигенам возбудителя в организме животного выработались антитела. Наиболее важным методом иммуноблотинга является диагностика клещевого боррелиоза (болезни Лайма), так как метод ИФА часто дает ложноположительные результаты. Кроме того, этот метод считается «золотым стандартом» в диагностике вируса иммунодефицита кошек.
4) Иммунохроматография («экспресс-тесты»).
По этому принципу изготавливается большое количество «быстрых тестов», которые широко используются в ветеринарных клиниках. Сыворотку, полученную от животного, наносят на мембрану, содержащую антиген, связанный с молекулами золота. Специфические антитела в сыворотке связываются с антигеном; образовавшийся комплекс антиген-антитело перемещается с потоком жидкости через тестируемую область, пока не достигнет матрицы, которая его связывает. Этот комплекс выглядит как розовая полоса в зоне осадков. Положительный контроль выглядит аналогично. Результат, который дают тесты, как правило, качественный – то есть отследить повышение или понижение уровня антител по ним невозможно. Некоторые тесты (например, для диагностики парвовирусного и коронавирусного энтерита, кошачьего лейкоза, кардиального дирофиляриоза) выявляют наличие соответствующего антигена в сыворотке крови — в этом случае результат является качественным [3].
Таким образом, были рассмотрены основные методы, применяемые на сегодняшний день для диагностики заразных болезней животных. Особое внимание хотелось бы обратить на то, что не существует универсального метода диагностики того или иного заболевания. Поэтому от врача требуется комплексный подход при постановке диагноза; необходимо учитывать анамнез, длительность
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Пути распространения инфекции разнообразны - через поврежденные кожные покровы, пищеварительный тракт, дыхательные пути, при непосредственном контакте с животными. Заражение возможно во время ухаживания и в драках, через предметы ухода и дрессировки.
Возникновение инфекционных процессов обусловлено наличием источника возбудителя во внешней среде, наличием сопутствующих заболеваний. К распространению инфекций предрасполагают условия содержания – количество питомцев, возможность выгула, посещение выставок или учебных площадок, путешествия, вязка и многое другое. Не стоит забывать и об отсутствии профилактических мер, первая и самая актуальная из которых – вакцинация.
Лечение инфекций обычно сводится к нескольким пунктам:
Идентификация возбудителя, включающая в себя исключение других причин, идентификацию и типирование (анализ, культивирование, метод ПЦР и др.).
Симптоматическая терапия для поддержания жизненно важных функций.
Направленное подавление возбудителя, если оно известно (например, антибиотикотерапия).
Ограничение распространения возбудителя и источника инфекции.
Не все инфекционные заболевания поддаются лечению. Летальность некоторых заболеваний сильно зависит от возраста и состояния питомца.
Ряд инфекций может передаваться человеку и вызывать ряд серьезных патологий: бесплодие; воспаление печени и почек; травмы желудочно-кишечного тракта и даже смерть.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
Анников, В.В. Инфекционные болезни собак и кошек / В.В. Анников - Саратов: Издво Научная книга, 2015. – 110с.
Гаскелл Р. М. Справочник по инфекционным болезням собак и кошек/ Р. М. Гаскелл , М. Беннет, - М.:ООО «Аквариум - Принт», 2015.-200 с.
Симпсон, Элс: Болезни пищеварительной системы собак и кошек / Симпсон Джеймс В., Элс Родерик У.- М.: Аквариум - Принт, 2014 . – 348 с. ISBN: 978-5-4238-0240-0.
Стекольников А.А. Болезни собак и кошек. Комплексная диагностика и терапия. Учебное пособие /А.А.Стекольников, Р.М. Васильев, Н.В. Головачева М.: СпецЛит. - 2013. - 925 с. ISBN: 978-5-299-00481-3.








2