Спектрофотометрия как экспресс метод диагностики качественного состава конденсированных сред различной физико-химической природы

Для максимальной эффективности расстояние между линиями должно быть как можно ближе к одной длине волны, а для УФ/видимых решеток плотность линий обычно составляет 1200 на 1 мм.Решетки имеют следующие преимущества перед призмами:(а) лучшее разрешение и передача энергии; (б) линейная дисперсия и, следовательно, постоянная ширина полосы; (в) требуется менее сложный механизм привода длины волны; (г) рассеянный свет ограничивается несовершенствами поверхности решетки.Оптическое оборудованиеПоскольку все измерения поглощения зависят от соотношения (I/I0), прежде чем замерять испытуемый образецнеобходимо записать спектр эталонного раствора. Эти измерения выполняются с использованием кюветы (по возможности кюветы для эталона и испытуемого образца должны быть идентичны), которая заполнена соответствующим растворителем и помещается на пути светового пучка. Эталонная интенсивность (I0) зависит от длины волны сложным многофункциональным образом (в основном из-за энергии источника, пропускания монохроматора, ширины щели и отклика детектора), поэтому важно при измерении поглощения повторно измерять эталон для каждой дискретной длины волны, на которой должно быть выполнено измерение. Все современные приборы основаны на микропроцессоре и имеют возможность сохранять базовую линию, то есть 100 % T или 0 A, установленную для каждой длины волны в диапазоне. Это позволило однолучевым спектрофотометрам конкурировать по производительности с более дорогими двухлучевыми приборами.Дополнительными преимуществами микропроцессорной обработки выходных данных детектора являются возможность вводить коэффициенты компонентов (например, данные о концентрации или молярной абсорбции) и представлять результаты в альтернативных форматах без дополнительного ручного расчета. Важным соображением в некоторых лабораториях является возможность взаимодействия с персональными компьютерами, чтобы результаты можно было включить в систему управления лабораторной информацией или перенести на диск для архивирования или обработки данных.Однолучевая оптикаРазвитие микропроцессора позволило добиться отличных результатов при использовании однолучевой конфигурации по сравнению с двухлучевой.Это приводит к большей оптической и механической простоте, как показано на рисунке Х. Сравнение между эталонной ячейкой и кюветой для образца достигается с помощью однолучевой аппаратуры путем подачи сигнала постдетектора на микропроцессор, который хранит эталонные данные для вычитания из сигнала образца. Уровни сигналов можно сравнивать между различными образцами на одной длине волны, на ряде заранее определенных длин волн или, если предусмотрен привод длины волны, можно получить полный спектр поглощения.Разделенная (эталонная) лучевая оптикаС появлением в спектрофотометрах ксеноновых ламп стала необходимой конфигурация с расщепленным лучом; это связано с тем, что вспышки высокой интенсивности от ксеноновой импульсной лампы не всегда имеют одинаковую величину. Таким образом, около 70 % энергии монохроматора проходит через образец, а остальная часть направляется на отдельный детектор с обратной связью, что позволяет учитывать падение/прирост энергии через контур усиления обратной связи в электронике детектора. Это стабилизирует систему и не требует больших дополнительных затрат.Двухлучевая оптикаТрадиционно предпочтительным методом была двулучевое оптическое оборудование в зоне манипуляций с образцами (рис. 23). Двухлучевая работа достигается за счет системы с разделением времени, в которой световой пучок направлен (с помощью вращающегося секционного зеркала или аналогичного устройства) попеременно через образец и ячейку сравнения. Функции прибора, зависящие от длины волны, значительно сокращены, что обеспечивает значительно улучшенные рабочие характеристики за счет системы обратной связи в опорном канале, которая регулирует коэффициент усиления детектора для компенсации изменений источника и детектора. Чтобы в полной мере использовать потенциал работы с двумя лучами, обычно добавляют сканирование по длине волны и какую-либо форму выходной записи: УФ-спектрофотометры этого типа после запуска автоматически создают спектр поглощения.Рисунок 23. Типичная двухлучевая оптика в области образцаОптика диодной матрицыЧетвертая оптическая конфигурация представляет собой диодную матрицу; здесь свет становится монохроматизированным после прохождения через образец, что означает отсутствие необходимости в крышке отсека для образца. Другое важное отличие состоит в том, что дисперсионный элемент (решетка) закреплен и не перемещается, как в более традиционных системах.Управление образцамиНа практике большая часть всех измерений производится на образцах в растворе. Пары и твердые вещества тоже могут быть приспособлены, но большинство приборов имеют стандартную кювету (или ячейку) в качестве обычного контейнера для проб. Дизайн, конструкция и материал кюветы так же важны для точных измерений, как и практика оператора и подготовка проб.Кюветы обычно изготавливаются из стекла или диоксида кремния (в зависимости от интересующего диапазона длин волн), чаще сплавляются, чем склеиваются (чтобы противостоять действию некоторых растворителей), и имеют следующие характеристики:1. Оптические окна (стороны, через которые проходит луч) тщательно отполированы, параллельны и плоские.2. Входная и выходная поверхности точно параллельны и ортогональны.3. Световой путь (расстояние между внутренними поверхностями окон) строго контролируется.Держатель, размещающий кювету в луче света, должен обеспечивать точное и воспроизводимое положение относительно пучка.Наиболее часто используемая кювета имеет длину пути света 10 мм, но более длинные или короткие длины пути полезны, если концентрация или поглощение выходят за пределы нормальных диапазонов без дальнейшей обработки, например, экстракция растворителем или разбавление. Микроячейки особенно полезны там, где объем пробы ограничен: газовые, проточные и одноразовые ячейки доступны для расширения полезности метода.Одноразовые пластиковые кюветы используются, чтобы избежать утомительных процедур промывки, особенно в приложениях с высокой пропускной способностью, таких как контроль качества. Совсем недавно стали доступны новые пластиковые материалы, пропускающие УФ-излучение.Абсорбционная спектрофотометрия является мощным средством как для идентификации неизвестных компонентов (качественный анализ), так и для измерения количеств присутствующих отдельных компонентов (количественный анализ). При качественной работе обычно необходимо измерять поглощение в диапазоне длин волн. Некоторая форма механизма сканирования длины волны и средства сравнения неизвестного образца с эталоном являются желательными характеристиками спектрофотометров, которые будут использоваться для построения спектров. Однако во многих лабораториях требуется измерять большое количество подобных образцов только на одной или нескольких длинах волн, например образцы крови в лаборатории патологии. Необходимость построения полного спектра поглощения возникает редко. Таким образом, в большинстве практических ситуаций однолучевые приборы предпочтительнее из-за скорости, удобства и простоты работы и, следовательно, снижения вероятности ошибки оператора. Требования к приборам обычно менее сложны и, следовательно, менее дороги.В помощь этому методу можно вручную ввести стандартный или эталонный раствор в световой путь через заданные интервалы времени для проверки настроек 0 % T и 100 % T. В таких случаях точность будет повышена, если эталонные растворы и растворы образцов будут содержаться в кюветах с близкими характеристиками пропускания на интересующей длине волны.ДетекторыСуществуетчетыре основные типа детекторов, встречающихся в спектрофотометрах:фотопроводящая ячейка,фотоумножитель, кремниевый диод и диодная матрица. Фотопроводящая ячейка (обычно это светочувствительный слой, например, селен на металлической подложке) почти никогда не встречается в приборах в связи с большими ограничениямикак по длине волны, так и по чувствительности. Наиболее часто встречающимися детекторами являются фотоумножитель, кремниевый диод и диодная матрица.ФотоумножительФотоумножители имеют внутреннее усиление, что дает им большую чувствительность и широкий спектральный диапазон. Свет вызывает испускание электронов фотокатодом, которые ускоряются,проходя мимо ряда динодов, поддерживаемых при постепенно увеличивающемся потенциале. Электроны, ударяющиеся о первый динод, испускают вторичное излучение, более сильное, чем первоначальный пучок, и так далее по цепочке динодов, создавая каскадный эффект. Концентрация электронов, выпущенная конечным динодом к аноду, может быть на много порядков больше, чем концентрация электронов с катода, но она остается пропорциональной интенсивности падающего излучения.Можно отметить два типа геометрии фотоумножителей: боковое окно и торцевое окно. В большинстве случаев торцевое окно позволяет облучать катод большей площади и является предпочтительной формой для инструментов с более высокими техническими характеристиками. Один фотоумножитель обеспечивает достаточную чувствительность во всем УФ/видимом диапазоне, но при этом придется заплатить значительную стоимость как за сам компонента, так и за источник питания и схемы управления.Кремниевый диодДетекторы на кремниевых диодах имеют рабочие характеристики, которые (при объединении устройства с операционным усилителем) сравнимы с характеристиками фотоумножителя, но имеют более широкий диапазон длин волн, при меньшей чувствительности. Они механически надежны (будучи полупроводниковыми устройствами), а электронные преимущества включают снижение требований к источнику питания и цепи управления.Диодная матрицаДиодная матрица представляет собой набор отдельных элементов детектора в линейной или матричной форме, которые в спектрофотометре могут быть установлены таким образом, чтобы весь спектр фокусировался на матрице соответствующего размера. Механизм изменения длины волны не требуется, а представление выходного сигнала происходит практически мгновенно. Однако разрешение ограничено физическим размером отдельных элементов детектора (обычно > 2 нм), а диапазон длин волн обычно ограничен примерно 1 октавой (200–400 нм, 300–600 нм, 400–800 нм). Это связано с тем, что в приборе с диодной матрицей трудно ввести фильтры для смягчения эффектов рассеянного света из спектра второго порядка.Измерительные системыОсновной функциейзаключительной части спектрофотометра является обеспечение сигнала (обычно электрического напряжения), который пропорционален поглощению образцом на данной длине волны. Системы обработки и измерения сигналов могут быть как простыми, как усилитель и измеритель, так и сложными, как персональный компьютер и принтер, в зависимости от применения.В простейшей форме счетчик будет служить либо для указания абсолютного значения выходного сигнала, либо, в некоторых случаях, для нулевой точки в цепи обратного выключения. Цифровые показания (светодиодные или жидкокристаллические) предпочтительнее из-за ясности и отсутствия двусмысленности, и их можно связать с микропроцессором, чтобы показания отображались в любых предпочтительных единицах – например, непосредственно в единицах концентрации. Диаграммные (или другие) записывающие устройства могут использоваться с приборами, оснащенными системами сканирования длины волны, для непосредственного получения спектра поглощения. Они также полезны при изучении скорости реакции, когда может потребоваться построить график зависимости поглощения от времени при фиксированной длине волны.Спектрофотометр EVOLUTION 300На протяжении более 60 лет одним из наиболее популярных и используемых поставщиков спектрофотометров является компания ThermoScientific. Серия спектрофотометров ThermoScientificEvolution 300/600 UV-Vis основана на успешном наследии продуктов Pye-Unicam, BauschиLomb, PhilipsScientific и Spectronic [23-25].На рисунке 24представлен общий внешний вид спектрофотометра Evolution 300.Рисунок 24. Внешний вид спектрофотометра Evolution 300Спектрофотометры серии Evolution 300/600 сочетают в себе высокопроизводительную оптическую конструкцию, универсальные пакеты программного обеспечения ThermoScientific VISION и аксессуары высочайшего качества для самых требовательных приложений. Системы предлагают множество преимуществ для широкого круга приложений, включая:• Биохимические науки о жизни;• Фармацевтика и контроль качества;• Материаловедение.Инновационные смарт-аксессуар обеспечивают простоту использования и повышенную производительность за счет:• Быстрая установка;• Полная интеграция программного обеспечения;• Отслеживание серийного номера для регулируемой среды.Варианты конфигурации системы обеспечивают максимальную гибкость для любой лаборатории:• Автономная версия локального управления;• Версия управления с ПК;• Сочетание обоих.В таблице 2сведены основные технические характеристики спектрофотометра Evolution 300.На рисунке 25 представлена оптическая схема спектрофотометра Evolution 300, которая включает в себя ксеноновую лампу-вспышку с длительным сроком службы и кремниевые фотодиодные детекторы с расширенным диапазоном длин волн. Эта система является отличным выбором для обычных и исследовательских лабораторий в области медико-биологических наук и фармацевтики.Таблица 2. Основные технические характеристики спектрофотометра Evolution 300Наименование характеристикиЗначения характеристикиСпектральный диапазон, нм190–1100Диапазон измерений спектральных коэффициентов направленного пропускания, %0–100Пределы допускаемой абсолютной погрешности спектрофотометров при измерении спектральных коэффициентов направленного пропускания, %± 1Пределы допускаемой абсолютной погрешности установки длин волн, нм± 1Спектральная ширина щели, нм0,5; 1; 1,5; 2; 4Уровень рассеянного света при (λ=340 нм), %0,02Габаритные размеры (Д×Ш×В), мм610×530×380Масса, кг30Потребляемая мощность, В-А140Напряжение питания частотой (50±1), Гц, В220 (+10…–15 %)Средний срок службы, лет8Условия эксплуатации:-диапазон температур окружающего воздуха, ℃-диапазон относительной влажности окружающего воздуха (при 25 ℃), %- диапазон атмосферного давления, кПа15–3520–8084–106Рисунок 25. Оптическая схема спектрофотометра Evolution 300ПриборEvolution 300 предлагает гибкость выбора конфигурации, соответствующей вашим потребностям: локальное управление, программное управление с ПК или локальное управление с программным управлением с ПК. Каждая из этих конфигураций предлагает различные уровни операционной гибкости, чтобы соответствовать индивидуальной или многопользовательской лабораторной среде.Локальное управлениеКонфигурация локального управления предлагает полный контроль над прибором, всестороннюю работу с методами и файлами данных, а также экономит место на рабочем столе. Он также может быть защищен паролем, что предотвращает нежелательный доступ к конфиденциальным данным. В презентационных целях экран локального управления можно просматривать на внешнем мониторе или проекционной системе с помощью выхода DVI.ПК-управлениеКонфигурация PC Control позволяет пользователям собирать данные и передавать их сторонним приложениям для расширенной обработки и архивирования. В многопользовательских средах локальное управление с программным обеспечением для ПК обеспечивает максимальную гибкость.Конфигурация программного управления ПК использует мощный набор программного обеспечения VISION для управления приборомEvolution 300. Это программное обеспечение позволяет собирать, хранить, воспроизводить и анализировать данные с помощью одной удобной программы. С помощью программного пакета VISION можно проводить от количественных измерений контроля качества до сложных ферментативных анализов.Объединенное локальное и компьютерное управлениеКонфигурация локального управления с программным обеспечением для ПК дает свободу выбора конфигурации, которая соответствует любым экспериментальным потребностям. Например, можно использоватьлокальное управление, чтобы быстро измерить абсорбцию для определения чистоты образца ДНК, при этом не нужно ждать загрузки ПК и программного обеспечения. Позже, чтобы запустить кинетический эксперимент на основе метода, хранящегося на сетевом диске, можно открыть программное обеспечение VISIONи переключить прибор на управление ПК. Эта конфигурация идеальна для лабораторий с различными экспериментальными потребностями.Спектрофотометр Evolution 300 идеально подходит для любой многопользовательской лаборатории биологических исследований. От пользователей, выполняющих быстрые или рутинные анализы, такие как тесты на нуклеиновые кислоты, до пользователей, выполняющих более сложные исследования, такие как кинетика Михаэлиса-Ментона или анализы термической денатурации/ренатурации, эти приборы предлагают конфигурацию, идеально подходящую для любой лаборатории.В качестве одного из примеров можно привести тесты на нуклеиновые кислоты. Концентрации ДНК/РНК можно определить простым соотношением или сканированием по длине волны. Опция сканирования по длине волны обеспечивает дополнительную гибкость проверки на наличие потенциальных загрязнений.Доступны различные методы квантования для определения концентрации очищенных двухцепочечных и одноцепочечных ДНК и РНК. На основе введенных пользователем факторов прибор измеряет оптическую плотность ДНК или РНК и рассчитывает соответствующую концентрацию.Необходимо отметить, что спектрофотометр Evolution 300 может быть дооснащен множеством аксессуаров для исследования различных образцов.Так, например, аксессуар диффузного пропускания позволяет устанавливать различные образцы перед интегрирующей сферой, предназначенной для обеспечения высокой производительности и соответствия нормативным стандартам. Доля порта составляет всего 2,9 %, что соответствует как методу AATCC 183:2004 для измерения коэффициента защиты от ультрафиолетового излучения тканей, так и методу ASTM D1003:2007 для измерения матовости пластмасс и стекол.Данный аксессуар открывает двери для измерения многих образцов, которые в прошлом было практически невозможно измерить. Этот аксессуар предлагает горизонтальный монтажный отражательный порт для удобного измерения как тонких, так и больших образцов. Двухлучевая интегрирующая сфера обеспечивает максимально возможную пропускную способность и точность. Порт пропускания включен для измерения диффузного пропускания твердых или мутных жидких материалов. ЗАКЛЮЧЕНИЕВ процессе достижения цели дипломной работы и решения поставленных задач были получены следующие результаты: было дано краткое описание метода, обозначены сферы использования данного метода, а так же описаны виды современных УФ-спектрофотометров. В результате изучения литературных источников по данной теме можно утверждать, что спектрофотометрия является перспективным методом анализа.СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫПентин, Ю.А. Физические методы исследования в химии / Ю.А. Пентин, Л.В. Вилков. – М.: Мир, 2003. – 683 с.Harris, D.C. Quantitative Chemical Analysis / D.C. Harris, C.A. Lucy.– W.H. Freeman, 2020.Lotfy, H.M. Recent development in ultraviolet spectrophotometry through the last decade (2006–2016): a review / H.M. Lotfy, S.S. Saleh, // Int. J. Pharm. Pharm. Sci. – 2016. –V. 8. –№ 10. –P. 40–66.Shinde, G.A Review on Advances in UV Spectroscopy / G.Shinde, R.K.Godage, R.S. Jadhav, M. Barhate, A.Bhagwat // Res. J. Sci. Tech.– 2020. –V. 12. –№ 1. – P. 47–51.Picollo, M. UV-Vis spectroscopy / M. Picollo, M. Aceto, T. Vitorino // PhysSci Rev. – 2019. – V. 4. – № 4.Бернштейн, И.Я. Спектрофотометрический анализ в органической химии / И.Я. Бернштейн, Ю.Я. Каминский. – Л.: Химия, 1986. – 200 с.Булатов, М.И. Практическое руководство по фотометрическим методам анализа / М.И. Булатов, И.П. Калинкин. – Л.: Химия, 1986. – 432 с.Bosch, O.C. Recent applications in derivative ultraviolet/visible absorption spectrophotometry: 2009–2011 / O.C. Bosch, R.F. Sanchez // Microchem J. – 2013. – V. 106. – P. 1–16.Verma, G. Development and optimization of UV-VIS spectroscopy – a review/ G.Verma, M. Mishra //World J. Pharm. Res.– 2018. –V. 7. –№ 11.Якимова, Л.С. Метод УФ-спектроскопии и его применение в органической и физической химии / Л.С. Якимова – Казань: Казан.ун-т, 2015. –19 с.Козлов, Д.В. Основные принципы спектроскопии и ее применение в химии : учебное пособие : [для студентов вузов] / Д.В. Козлов, Г.А. Костин, А.П. Чупахин. –Редакционно-издательский центр НГУ, 2008.– 121 с.Черданцева, Е.В. Молекулярно-абсорбционный метод анализа органических веществ: [учеб.-метод. пособие] / Е.В. Черданцева, И.В. Гейде, В.Г. Китаева, В.М. Зыскин, Н.В. Марина, А.И. Матерн. – Изд-во Урал.ун-та, 2015. – 96 с.Tranter, G.E. UV-VisibleAbsorptionandCircularDichroismSpectroscopy, InorganicChemistryApplications / G.E. Tranter // Encyclopediaofspectroscopyandspectrometry. – 2017. – V. 4. – P. 488–490.Rodger, A. UV-visible absorption spectroscopy, biomacromolecular applications / A. Rodger, K. Sanders // Encyclopedia of spectroscopy and spectrometry. – 2017. – V. 4. – P. 495–502.Redasani, V.K. A review on derivative UV-spectrophotometry analysis of drugs in pharmaceutical formulations and biological samples / V.K.Redasani, P.R. Patel, D.Y.Marathe, S.R.Chaudhari, A.A.Shirkhedkar, S.J. Surana // Journal of the Chilean Chemical Society. – 2018. – V. 63. –№ 3. – P. 4126–4134.Leder, P.J.S.The Importance of UV-Vis spectroscopy: application in food products characterization / P.J.S.Leder, O.M.Porcu // Scholarly J. Food and Nutrition. – 2018. – V. 1. –№ 3.Buss, V. UV-Visible Absorption Spectroscopy, Dyes and Indicators Applications / V. Buss, L. Eggers // Encyclopedia of spectroscopy and spectrometry. – 2017. – V. 4. – P. 503–510.Edwards, A.A. UV-Visible Absorption Spectroscopy, Organic Applications / A.A. Edwards, B.D. Alexander // Encyclopedia of spectroscopy and spectrometry. – 2017. – V. 4. – P. 511–519.Yu, J. Review of recent UV–Vis and infrared spectroscopy researches on wine detection and discrimination / J. Yu, H. Wang, J. Zhan, W. Huang // ApplSpectrosc Rev. – 2018. – V. 53. – № 1. – P. 65–86.Spangenberg, M., Ultraviolet absorption of contaminants in water / M. Spangenberg, J.I. Bryant, S.J. Gibson, P.J. Mousley, Y. Ramachers, G.R. Bell // Sci. Rep.–2021. – V. 11. – Art № 3682.Gonzalez-Morales, D.Development of a low-cost UV-Vis spectrophotometer and its application for the detection of mercuric ions assisted by chemosensors/ D. Gonzalez-Morales, A. Valencia, A. Diaz-Nunez, M. Fuentes-Estrada, O. Lopez-Santos, O. Garcia-Beltran // Sensors (Basel). – 2020. – V. 20. № 3. – P. 906–921.Passos, M.L., Detection in UV-visible spectrophotometry: Detectors, detection systems, and detection strategies / M.L.Passos,M.L.M. Saraiva// Measurement. –2019. –V. 135. – P. 896–904.Спектрофотометрысерии Evolution 300. Available online: http://www.spektronika.ru/product/spektrofotometry-serii-evolution-300.Thermo Fisher Scientific Evolution 300 PC UV-Vis Spectrophotometer. Available online: https://americanlaboratorytrading.com/lab-equipment-products/thermo-fisher-scientific-evolution-300-pc-uv-vis-spectrophotometer_17778.Спектрофотометры Evolution 300, Evolution 600. Available online: https://all-pribors.ru/opisanie/44865-10-evolution-300-evolution-600-47224.